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Trizol法做qPCR详细操作经验
发布时间: 2018-09-27 10:25:59 | 317 次浏览
                           Trizol法做qPCR详细操作经验



一、样品处理
1. 组织样品
将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解。
注1：样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
注2：组织样品收取后应立即处理或液氮冷冻并-80摄氏度保藏。胰腺组织样品因其各种酶含量极其丰富，应尤为注意，研磨过程中注意保持样品低温状态。
2. 贴壁细胞样品
弃去细胞培养皿中培养基，根据下表加入适量 Trizol溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml 无酶EP管中，室温静置5min，使细胞充分裂解。
 
培养皿 Trizol体积
3.5cm皿（6孔板） 1mL
6cm皿 3mL
10cm皿 10mL
注：加入Trizol溶液后，可将培养皿放入-80℃冰箱，20min后取出化开，通过冻融增加细胞裂解效果。
3. 悬浮细胞
500g×5min离心收集细胞，弃去培养基，约5-10×106细胞加入1mL Trizol溶液，吹打混匀，室温静置5min，使细胞充分裂解。
备注：为了保证较好的提取效果，建议使用Invitrogen生产的Trizol。

二、使用Trizol提取RNA
1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。
2、12,000rpm 离心5min，弃沉淀。
3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
（氯仿为有机溶剂，有效的使有机相和无机相迅速分离。有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和RNA脱离，RNA进入水相）
4、4℃ 12,000g离心15min。
5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
6、按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇（沉淀RNA）混匀，室温放置5-10min。
7、4℃ 12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
8、按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇（沉淀RNA），温和振荡离心管，悬浮沉淀。
9、 4℃ 8,000g离心5min，尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
11、可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。
（TE缓冲液由Tris和EDTA配制而成，主要用于溶解核酸，能稳定储存DNA和RNA。用于酶切反应不能使用SDS）
12、测O.D值。注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-2.2之间。

备注：1、组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量；组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染，在纯度和产量之间，保证较好的纯度更为重要，并且提取的RNA只要量足够下游实验使用即可，不是越多越好。
2、高蛋白、脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后须4℃ 12,000g离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉；
3、热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase的主要来源；
4、分离组织时间尽量缩短，因为组织内含有非常多的RNA酶，所以如果不能及时将组织冻存起来或者抓紧时间用新鲜组织做RNA提取实验，则建议用组织RNA保护剂减缓RNA降解的速度。（建议使用EZBioscience的RNA Protector）
5、组织块用液氮研磨，效果最好，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎，然后再充分研磨。
6、Trizol试剂含有致癌物质，所以使用Trizol法做RNA提取实验时一定要注意戴好手套，同时戴好口罩减少有毒气体的吸入，中间操作时注意避免皮肤接触到试剂，如果万一不幸接触，要及时用清水冲洗，严重者需到医院就医做进一步处理治疗。

三、逆转录
1、用gDNA Remover处理RNA：取100ng~2 μg总RNA（一般用1 μg即可），加入2 μl gDNA Remover，用移液器轻柔吹打5~10次混匀，室温（约25℃）反应5分钟，置于冰上待用。（EZBioscience的gDNA Remover反应系统经过特殊的优化，仅需室温（25℃）反应5分钟，就能降解95%以上的基因组DNA，极大的降低了Trizol提取的RNA中残留的基因组对结果的干扰。）
2、按照如下体系配制逆转录反应体系：
 
成分 体积（20 μl体系）
gDNA Remover处理过的总RNA 上述体积（X μl）
4×RT Master Mix 5 μl
ddH2O 补足到20 μl
 
3、用移液器轻柔吹打10次充分混匀（很重要，移液器体积可调到18 μl）。
4、42℃反应15分钟（水浴锅、金属浴、PCR仪均可），稀释后作为模板进行qPCR或者冻存于-80度冰箱保存。
5、逆转录产物通常建议稀释5~10倍然后使用（即稀释到100~200 μl，使用前，须用移液器调到相应量程吹打10次充分混匀，很重要）。20 μl qPCR体系一般可用2 μl稀释后的cDNA（可在1~4 μl之间调整）。

备注：1、以上逆转录操作为使用EZBioscience的预混型快速逆转录试剂盒（货号为A0010GQ）的步骤，这款试剂盒包含了去除基因组DNA的高效Dnase，所以能够极大地降低Trizol提取的RNA中残留的基因组对结果的干扰。
2、如果做miRNA，则需用专门的miRNA逆转录试剂盒，可用颈环法逆转出需要研究的miRNA,但是需要针对每一种miRNA合成特异性的引物，操作比较麻烦，所以建议用加尾法试剂盒可以一次将所有的miRNA试剂盒逆转出来，能极大地降低实验操作的难度，如果用颈环法可用货号为A0010T或A0010G的逆转录试剂盒，如果用加尾法可用货号为EZB-miRT2的试剂盒。
3、当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液，然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。

四、qPCR加样上机
    使用EZBioscience的2× SYBR Green qPCR Master Mix(货号为A0001)。
（一）、请根据以下仪器型号选择不同的ROX染料
 
 
Do Not Use ROX		 Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™,Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;
Cepheid SmartCycler®; Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qPCR;
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000; Roche LightCyclerTM 480;
Thermo Scientific PikoReal Cycler.
Use ROX 1 (1×) ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast; StepOne™, StepOne Plus™
Use ROX 2 (1×) ABI 7500, 7500 Fast, Quanti-Studio 3, 5, 6, 7, 12K Flex, Dx, ViiA™7; Stratagene MX4000™, MX3000P™, MX3005P™
（二）、简要操作步骤
1、使用前将2×qPCR Mix及ROX试剂取出，室温放置5~10分钟，或用手紧握试剂管使之充分融化，然后上下颠倒5~10次混匀。
2、假定cDNA在使用前已经加水稀释10倍（20 μl cDNA加180 μl ddH2O稀释至200 μl）
按照如下表格进行qPCR反应体系加样：
 
成分 10 μl 体系 20 μl 体系
总体积 10 20
2 × SYBR Green qPCR Master Mix 5 10
cDNA 2（可用2 ~8 μl稀释10倍后的cDNA） 4（可用2 ~8 μl稀释10倍后的cDNA）
正向引物 (10 μM) 0.2 0.4
反向引物 (10 μM) 0.2 0.4
ROX（50×，根据仪器型号选择） 0.2 0.4
ddH2O 补足到 10 补足到 20
3、加样完成后，盖上封板膜，用离心机1000 rpm离心1分钟，将液体离心至qPCR孔板底部。
4、qPCR反应程序如下：
 
Step 1 2
热启动酶活化 PCR反应
    循环数 (40 cycles)
解链 退火&延伸
温度 95 °C 95 °C 60 °C
时间 5 min 10 sec 30 sec
体积 20μL/ 50μL
然后按照仪器默认的程序添加溶解曲线。
注意：95 °C反应5分钟的目的是活化热启动酶，因此此步骤为必须步骤，不能省略。
下方表格提供了一种代表性的熔解曲线程序供参考：
 
熔解曲线 (扩增程序后紧接着进行如下反应)
Step 1 2 3 4
加热或降温速度 100% 100% 1% 100%
温度 95 °C, 60 °C 95 °C 60 °C
时间 15 sec 1 min 30 sec 15 sec
采集数据 - - 升温阶段
采集数据		 -

五、关于qPCR反应是否良好的判断
1、如果扩增曲线呈典型的S型曲线，初始阶段、指数扩增阶段及平台期均完整可见，熔解曲线单峰，内参Ct值在合理范围内（通常可在13~22之间，典型的内参Ct值在15~20之间），则可认为该反应正常；
2、如果同一个模板和引物的重复孔数据Ct值相差0.5以内；
同时满足以上两个条件的可以认为数据可用。

六、常见的注意事项、操作要点及优化方法
1、实验开始前首先验证引物是否适用，标准与上述标准类似，主要观察扩增曲线与熔解曲线；
2、引物验证后应该分装为几份，防止污染或降解；
3、RNA的质量及cDNA的质量对qPCR的结果具有很大的影响，如果Trizol做的不是非常熟练，建议用试剂盒提，可以细胞到cDNA试剂盒直接获得cDNA（EZBioscience，货号B0003），也可以用RNA快速提取试剂盒（EZBioscience，货号B0004D或EZB-RN001-PLUS）抽提，应尽量保证RNA不降解，通常建议RNA提取后尽快进行逆转录，避免反复冻融，或者多次逆转录。如果预计使用量较大，则可以一次多逆转几管cDNA。如果条件允许，cDNA建议优先保存在-80度冰箱（在-20度短时间保存问题不大，长时间保存能够观察到存在降解）。

七、关于qPCR引物的设计
1、首先可以查询Google Scholar中的文献当中的引物，通常中等及以上水平期刊中的qPCR引物绝大多数可以直接使用；
2、NCBI数据库的Blast数据库中的primer blast提供了针对序列或者Gene ID的qPCR引物设计方案，可以每条基因设计2对进行合成、验证；
3、Primer Bank数据库中有部分已经验证过的引物可用，也可作为参考。