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离心柱法试剂盒做qPCR操作经验
发布时间: 2018-09-27 10:25:59 | 346 次浏览
离心柱法试剂盒做qPCR操作经验

 
一、RNA提取
1、样品裂解；
2、RNA结合（过柱）；
3、洗涤；
4、RNA洗脱。
5、测O.D值。注：此方法提取RNA 纯度较高，A260/A280值在2.0左右。备注：如果做细胞，详细操作步骤可下载查阅EZBioscience旗下EZ-press RNA Purification Kit（货号B0004D）说明书；如果做组织或细胞，详细操作步骤可下载查阅EZBioscience旗下Tissule RNA Purification Kit（货号EZB-RN001-PLUS）说明书。

二、逆转录
1、用gDNA Remover处理RNA：取100ng~2 μg总RNA（一般用1 μg即可），加入2 μl gDNA Remover，用移液器轻柔吹打5~10次混匀，室温（约25℃）反应5分钟，置于冰上待用。（EZBioscience的gDNA Remover反应系统经过特殊的优化，仅需室温（25℃）反应5分钟，就能降解95%以上的基因组DNA，极大的降低了Trizol提取的RNA中残留的基因组对结果的干扰。）
2、按照如下体系配制逆转录反应体系：
成分 体积（20 μl体系）
gDNA Remover处理过的总RNA 上述体积（X μl）
4×RT Master Mix 5 μl
ddH2O 补足到20 μl
 
3、用移液器轻柔吹打10次充分混匀（很重要，移液器体积可调到18 μl）。
4、42℃反应15分钟（水浴锅、金属浴、PCR仪均可），稀释后作为模板进行qPCR或者冻存于-80度冰箱保存。
5、逆转录产物通常建议稀释5~10倍然后使用（即稀释到100~200 μl，使用前，须用移液器调到相应量程吹打10次充分混匀，很重要）。20 μl qPCR体系一般可用2 μl稀释后的cDNA（可在1~4 μl之间调整）。

备注：1、以上逆转录操作为使用EZBioscience的预混型快速逆转录试剂盒（货号为A0010GQ）的步骤，这款试剂盒包含了去除基因组DNA的高效Dnase，所以能够极大地降低Trizol提取的RNA中残留的基因组对结果的干扰。
2、如果做miRNA，则需用专门的miRNA逆转录试剂盒，可用颈环法逆转出需要研究的miRNA,但是需要针对每一种miRNA合成特异性的引物，操作比较麻烦，所以建议用加尾法试剂盒可以一次将所有的miRNA试剂盒逆转出来，能极大地降低实验操作的难度，如果用颈环法可用货号为A0010T或A0010G的逆转录试剂盒，如果用加尾法可用货号为EZB-miRT2的试剂盒。
3、当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液，然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。

三、qPCR加样上机
    使用EZBioscience的2× SYBR Green qPCR Master Mix(货号为A0001)。
（一）、请根据以下仪器型号选择不同的ROX染料
 
Do Not Use ROX		 Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™,Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;
Cepheid SmartCycler®; Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qPCR;
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000; Roche LightCyclerTM 480;
Thermo Scientific PikoReal Cycler.
Use ROX 1 (1×) ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast; StepOne™, StepOne Plus™
Use ROX 2 (1×) ABI 7500, 7500 Fast, Quanti-Studio 3, 5, 6, 7, 12K Flex, Dx, ViiA™7; Stratagene MX4000™, MX3000P™, MX3005P™
（二）、简要操作步骤
1、使用前将2×qPCR Mix及ROX试剂取出，室温放置5~10分钟，或用手紧握试剂管使之充分融化，然后上下颠倒5~10次混匀。
2、假定cDNA在使用前已经加水稀释10倍（20 μl cDNA加180 μl ddH2O稀释至200 μl）
按照如下表格进行qPCR反应体系加样：
成分 10 μl 体系 20 μl 体系
总体积 10 20
2 × SYBR Green qPCR Master Mix 5 10
cDNA 2（可用2 ~8 μl稀释10倍后的cDNA） 4（可用2 ~8 μl稀释10倍后的cDNA）
正向引物 (10 μM) 0.2 0.4
反向引物 (10 μM) 0.2 0.4
ROX（50×，根据仪器型号选择） 0.2 0.4
ddH2O 补足到 10 补足到 20
3、加样完成后，盖上封板膜，用离心机1000 rpm离心1分钟，将液体离心至qPCR孔板底部。
4、qPCR反应程序如下：
Step 1 2
热启动酶活化 PCR反应
    循环数 (40 cycles)
解链 退火&延伸
温度 95 °C 95 °C 60 °C
时间 5 min 10 sec 30 sec
体积 20μL/ 50μL
然后按照仪器默认的程序添加溶解曲线。
注意：95 °C反应5分钟的目的是活化热启动酶，因此此步骤为必须步骤，不能省略。
下方表格提供了一种代表性的熔解曲线程序供参考：
熔解曲线 (扩增程序后紧接着进行如下反应)
Step 1 2 3 4
加热或降温速度 100% 100% 1% 100%
温度 95 °C, 60 °C 95 °C 60 °C
时间 15 sec 1 min 30 sec 15 sec
采集数据 - - 升温阶段
采集数据		 -

四、关于qPCR反应是否良好的判断
1、如果扩增曲线呈典型的S型曲线，初始阶段、指数扩增阶段及平台期均完整可见，熔解曲线单峰，内参Ct值在合理范围内（通常可在13~22之间，典型的内参Ct值在15~20之间），则可认为该反应正常；
2、如果同一个模板和引物的重复孔数据Ct值相差0.5以内；同时满足以上两个条件的可以认为数据可用。

五、常见的注意事项、操作要点及优化方法
1、实验开始前首先验证引物是否适用，标准与上述标准类似，主要观察扩增曲线与熔解曲线；
2、引物验证后应该分装为几份，防止污染或降解；
3、RNA的质量及cDNA的质量对qPCR的结果具有很大的影响，应尽量保证RNA不降解，通常建议RNA提取后尽快进行逆转录，避免反复冻融，或者多次逆转录。如果预计使用量较大，则可以一次多逆转几管cDNA。如果条件允许，cDNA建议优先保存在-80度冰箱（在-20度短时间保存问题不大，长时间保存能够观察到存在降解）。

六、关于qPCR引物的设计
1、首先可以查询Google Scholar中的文献当中的引物，通常中等及以上水平期刊中的qPCR引物绝大多数可以直接使用；
2、NCBI数据库的Blast数据库中的primer blast提供了针对序列或者Gene ID的qPCR引物设计方案，可以每条基因设计2对进行合成、验证；
3、Primer Bank数据库中有部分已经验证过的引物可用，也可作为参考。