首页 — 技术资料 — 产品使用注意事项
技术资料/Technology
Cell to cDNA Kit PLUS做HepG2细胞注意事项（其他细胞也可参考）
发布时间: 2018-09-27 10:25:59 | 362 次浏览
           使用Cell to cDNA Kit PLUS做HepG2细胞注意事项



1、HepG2细胞属于个头较大的贴壁生长的癌细胞，建议用24孔板培养。

2、种细胞时多种一个孔，用来在做实验时简单计一下数（公司可免费提供血球计数板和盖玻片）。

3、收细胞时每个孔内的细胞尽量超过10万个（最好20万左右），以使所加裂解液的量足够覆盖完孔板底部。

4、做实验时可在开放的实验台上进行，如果想在通风橱内做，不要开风机，以免把裂解液吹干了导致RNA大量降解。

5、吸取培养基，用PBS洗一遍，吸干净。用PBS洗的时候轻轻摇晃几下孔板即可，不要用枪吹打，以免把细胞吹掉导致丢失细胞。

6、如果样品数较多，不要所有的孔都吸完PBS后再加裂解液，以防止前面的孔里的细胞干死导致RNA快速降解。可以五六个孔为一组操作，一组吸去PBS后即加入裂解液，然后再进行下一组操作。
7、按50~80μL/10万细胞的比例加入Cell Lysis Buffer,吹打数次（尽量把有细胞的区域全部吹到），对于比较结实的细胞，可放室温放置或摇床摇3分钟以充分裂解细胞（不超过5min）。裂解结束后，吹打几次混匀后吸取4μL（最大可以用8μL）至新的EP管中，加入0.8μL gDNA Remover,轻柔吹吸混匀，25℃放置5min充分去除基因组DNA。

8、裂解去gDNA完成后，放置在冰上，并加入逆转录试剂，尽快进行逆转录。（可在上一步等待时提前配置好逆转录体系，这样在去gDNA完成后不用放置在冰上，即可直接取4.8μL Cell Lysate加入逆转体系中）。

9、逆转录反应体系配好后，充分混匀（很重要），42℃（可以用水浴、金属浴、PCR仪）反应15min即得到cDNA。然后稀释一定倍数后（一般稀释5倍，也可根据所研究基因的丰度高低调整稀释倍数）作为qPCR模板使用。如不能立即做qPCR,则建议将cDNA冻存于-80℃保存备用。